Manipulation de cellules de plaque neurale par nano-injection in utero dans un modèle de souris embryonnaire

Résumé

Source : Mangold, K., H el. al., Ciblage de la plaque neurale murine par nano-injection in utero (NEPTUNE) au jour embryonnaire 7,5. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo démontre la méthode de nano-injection in utero pour le ciblage des plaques neurales dans un modèle de souris embryonnaire. Une solution lentivirale à titre élevé est injectée dans la cavité amniotique, où elle s’intègre dans les cellules de la plaque neurale, permettant une manipulation génique stable pour la recherche neurodéveloppementale et les applications thérapeutiques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Injections

REMARQUE : Tous les instruments utilisés dans cette procédure sont stérilisés avant l’intervention chirurgicale et entre chaque souris.

1. Anesthésier la première femme avec des cavités de taille idéale.
2. Placez et fixez la femelle sur la table.
3. Appliquez un gel pour les yeux sur les yeux pour prévenir la dessiccation de la cornée et injectez des analgésiques par voie sous-cutanée.
   REMARQUE : Analgésiques recommandés : Buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg de poids corporel) ou Flunixine (2,5 mg/kg) ou similaire conformément aux réglementations locales en matière de bien-être animal. L’analgésie périopératoire multimodale est maintenue avec des analgésiques injectés et de l’isoflurane.
4. Préparez aseptiquement le bas-ventre en l’essuyant avec un chiffon imbibé d’une solution de chlorhexidine à 0,5 mg/ml (ou similaire) et séchez la peau. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision cutanée verticale de 1,5 à 2,0 cm dans la partie inférieure de l’abdomen.
   REMARQUE : Préparez la zone chirurgicale en suivant les routines de désinfection approuvées localement.
5. Soulevez doucement la peau et libérez la peau de la couche musculaire sous-jacente, environ 1 cm autour du point d’incision, pour faciliter la suture après la chirurgie.
6. Faites une incision verticale de 1 cm sur la ligne médiane dans la couche musculaire.
7. À l’aide d’une paire de pinces, soulevez un côté de la peau et de la couche musculaire, et avec l’autre paire, recherchez les cornes utérines.
   REMARQUE : Les déciduas sont disposés comme des perles sur un collier, tandis que l’intestin est constitué d’un long tube continu (Figure 1A).
8. À l’aide d’une pince, retirez avec précaution les deux cornes utérines de l’abdomen. Tenir le tissu entre les embryons ; ne les pressez pas directement (Figure 1B).
   REMARQUE : L’utérus est attaché au corps au niveau du col de l’utérus, et les deux ovaires/oviductes sont attachés par des ligaments. Ne tirez pas/ne détachez pas l’utérus de ces points d’ancrage.
9. Comptez et notez le nombre d’embryons sur les côtés gauche et droit.
10. Numérotez les embryons soit de l’ovaire au col de l’utérus, soit du col de l’utérus à l’ovaire.
    REMARQUE : Ceci est particulièrement important si les embryons injectés doivent être prélevés aux stades embryonnaires.
11. À l’aide d’un coton-tige humide, repoussez doucement tous les embryons dans la cavité abdominale, à l’exception des trois premiers à injecter.
12. Placez une goutte de PBS (solution saline tamponnée au phosphate) sur l’élastique de la boîte de Pétri et maintenez-la immédiatement au-dessus des embryons.
13. Insérez une pince fermée dans l’incision de l’élastique et relâchez la pince pour ouvrir l’incision élastique afin que le liquide tombe sur les embryons.
    REMARQUE : Cela garantit la réhydratation des embryons et que la membrane élastique adhère à la peau humide de la femelle, empêchant ainsi les fuites de PBS dans les étapes suivantes.
14. Tirez une section de l’utérus, correspondant à trois embryons, à travers l’élastique avec une pince, et perchez doucement la boîte de Pétri sur l’abdomen de la femelle.
15. À l’aide de la pince et d’un coton-tige humide, ajustez le positionnement de l’utérus et l’élastique pour vous assurer que l’élastique est scellé à la peau de la femme afin d’éviter les fuites de PBS.
16. Utilisez les quatre pieds d’argile pour fixer et fixer la boîte de Pétri immédiatement au-dessus de l’abdomen, réduisant ainsi la pression sur la femelle et la sensibilité de l’imagerie à la respiration et au rythme cardiaque de la femelle.
17. Appuyez sur le cylindre de pâte à modeler vers le bas à droite des embryons/utérus pour fixer l’utérus (Figure 1C).
    REMARQUE : Cette instruction d’orientation suppose que l’aiguille est à gauche de la femelle et que les embryons de la corne utérine gauche de la femelle sont exposés. Le côté de l’utérus (corne utérine gauche ou droite) est crucial car l’amniotique (AC) fait face à l’aiguille (corne gauche ; Graphique 1D) ou fait face au cylindre d’argile stabilisateur (corne droite ; Figure 1E).
18. Pour injecter des embryons à partir de la corne utérine droite, placez le cylindre d’argile sur le côté gauche des embryons (Figure 1F) et tournez la table chauffante à 180° (Figure 1G) pour obtenir la bonne orientation. Si l’aiguille peut être déplacée à la place, adaptez-la en fonction de la configuration concernée.
19. Ajoutez du PBS dans la boîte de Pétri jusqu’à ce que les embryons et l’utérus soient recouverts de PBS.
20. Abaissez la sonde d’échographie dans le PBS et ajustez la souris/la table chirurgicale de manière à ce que le premier embryon soit aligné avec la sonde d’échographie pour faciliter l’enregistrement des injections.
    REMARQUE : « First » fait référence à la numérotation des embryons de l’ovaire au col de l’utérus.
21. Examinez les trois embryons et inspectez les CA. Déterminez le volume d’injection comme suit :
    1. Mesurez le diamètre du CA avec l’appareil à ultrasons. Injecter 69 nL si le diamètre AC est de ≤0,2 mm ; injecter 2 x 69 nL (= 138 nL) si le diamètre AC est de >0,2 mm et ≤0,29 mm ; et injecter 3 x 69 nL (= 207 nL) si le diamètre AC > de 0,29 mm (Figure 1H).
       >REMARQUE : Des expériences antérieures ont montré que des volumes d’injection allant jusqu’à 207 nL sont bien tolérés à E7.5. Des injections réussies avec un impact minimal sur la survie sont obtenues lorsque l’augmentation du volume relatif de l’AC ne dépasse pas 90 %. La variation de la taille de la CA entre les compagnons de portée ou les souches de souris est courante et peut nécessiter une optimisation supplémentaire.
22. Réglez les volumes d’injection à l’aide du contrôleur d’injection.
23. Réglez la vitesse d’injection sur lente avec un taux d’injection de 23 nL/s.
    REMARQUE : Différents modèles d’équipement peuvent entraîner des forces d’injection différentes.
24. Abaissez l’aiguille dans le PBS à l’aide des roues principales du système de rail (plans x et z, Figure 1I) et appuyez sur Empty sur le contrôleur du nanoinjecteur jusqu’à ce que le liquide atteigne la pointe de l’aiguille.
    REMARQUE : Si l’aiguille s’est bouchée, appuyez sur Empty pour dissoudre le bouchon et/ou expulser le bouchon.
25. Soulevez l’aiguille du PBS et appuyez sur Injecter. Vérifiez qu’une goutte du volume approximatif souhaité est évacuée.
26. Abaissez l’aiguille dans le PBS et alignez-la avec la sonde à ultrasons et l’embryon en déplaçant le nanoinjecteur avec la roue du plan Y sur le micromanipulateur (Figure 1J).
    REMARQUE : La pointe de l’aiguille est parfaitement alignée lorsqu’elle apparaît comme un point lumineux sur l’image de l’échographie (Figure 1K,L). L’aiguille peut être déplacée dans les trois plans de direction à l’aide du micromanipulateur.
27. Ajustez l’angle de l’aiguille à l’aide de la roue d’angle d’injection pour assurer un angle d’injection presque perpendiculaire par rapport à la paroi utérine. Insérez l’aiguille dans le CA en un seul mouvement à l’aide de la roue d’injection du micromanipulateur (Figure 1J-M). Gardez un œil sur la luminosité de la pointe de l’aiguille. Si la pointe de l’aiguille disparaît de l’image de l’échographie, déplacez la sonde d’échographie vers l’avant ou vers l’arrière pour ramener l’aiguille au point.
    REMARQUE : Une fois que l’aiguille est à l’intérieur de l’AC, des modifications mineures de la position et de la mise au point de l’aiguille peuvent être apportées sans nuire à l’embryon (ajustements à ~0,3 mm). N’ajustez pas la position de l’aiguille plus que cela.
28. Appuyez sur Inject (pour 207 nL, réglez le volume à 69 nL et injectez trois fois). Après l’injection, attendez 5 à 10 secondes supplémentaires avant de rétracter l’aiguille d’un mouvement doux.
29. Passez à l’embryon suivant et répétez les étapes 1.22-1.26 pour les deux autres embryons s’ils ont des tailles AC appropriées.
30. Soulevez la sonde à ultrasons et l’aiguille hors du PBS à l’aide du micromanipulateur. Tournez l’aiguille loin de l’opérateur pour éviter de l’endommager et de vous blesser.
31. À l’aide d’une pince, redirigez les 1er et 2e embryons dans l’abdomen de la femelle en les poussant doucement à travers l’élastique. Saisissez doucement le tissu adjacent au 3ème embryon et tirez l’utérus vers l’extrémité supérieure de l’incision élastique. Tirez doucement les 4ème à 6ème embryons avec des pinces et laissez le 3ème embryon rentrer dans l’abdomen.
    REMARQUE : Cette étape peut être effectuée sans changer le PBS ni retirer la boîte de Pétri.
32. Répétez l’opération au besoin jusqu’à ce que tous les embryons avec des CA optimaux aient été injectés ou que la limite de temps ait été atteinte.
33. Repoussez doucement les embryons/utérus dans l’abdomen de la femelle.
34. Aspirez le PBS et retirez la boîte de Pétri. Si un virus a été utilisé, traitez-le comme un déchet infectieux.
35. Cousez la couche musculaire avec du Vicryl (USP 6-0, longueur de l’aiguille 13 mm, cercle 3/8) en sutures simples continues ou interrompues et fermez la peau avec 1-2 clips (voir le tableau des matériaux).
36. Éteignez la pompe à isoflurane.
37. Retirez le ruban chirurgical et placez la femelle en position couchée (ventre vers le bas) dans une cage propre sur une plaque chauffante à 40 °C.
    REMARQUE : La femelle doit reprendre conscience et être mobile dans les 10 minutes. Assurez-vous que la procédure est terminée dans les 30 minutes. Le patrimoine génétique, l’âge et le poids de la femme peuvent influencer la sensibilité à l’anesthésie. Surveillez les souris pendant la chirurgie pour détecter des signes de respiration lente (une respiration lente signifie que l’anesthésie est trop profonde) ou de mouvement (l’anesthésie est trop légère). La buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg de poids corporel) ou la flunixine (2,5 mg/kg) ou similaire, conformément aux réglementations locales en matière de bien-être animal, peuvent être fournies 8 heures après la première injection si nécessaire.
38. Si une autre femelle doit être injectée, préparez la zone chirurgicale tout en surveillant le réveil de la première.
    1. Essuyez les outils chirurgicaux avec de l’éthanol à 70 % pour éliminer tout résidu de sang ou de tissu et stérilisez-les dans le stérilisateur à billes de verre préchauffé pendant 10 s. Jetez les cotons-tiges et utilisez du papier de soie. Essuyez la boîte de Pétri et les morceaux d’argile avec du papier de soie.
39. Répétez les étapes 1.1 à 1.35 jusqu’à ce que toutes les femelles aient été injectées.
40. Videz et jetez l’aiguille.
    1. S’il reste un virus ou une solution d’injection dans l’aiguille, appuyez sur Empty sur le nanoinjecteur et videz le contenu de l’aiguille sur du papier de soie.
    2. Rétractez complètement le piston métallique en appuyant sur Fill jusqu’à ce qu’il y ait un double bip du contrôleur, qui indique que le piston est complètement rétracté.
    3. Desserrez la pince et faites glisser l’aiguille du piston métallique. Jetez l’aiguille dans le contenant des déchets pour objets tranchants.
41. Nettoyez le banc BSL-2 (niveau de biosécurité 2).
    1. Si un virus a été utilisé, vaporisez tout le champ opératoire avec un désinfectant (voir le tableau des matériaux). Après 15 min, essuyez le désinfectant et nettoyez l’ensemble du champ opératoire avec de l’éthanol à 70 %. Si aucun virus n’a été utilisé, nettoyez toutes les surfaces avec de l’éthanol à 70 %.
    2. Essuyez tout PBS restant de la sonde à ultrasons avec du papier de soie sec, doux et non pelucheux.
42. Jetez les déchets conformément aux directives de biosécurité.
43. Éteignez l’échographe, la table chauffante, le banc BSL2 et l’alimentation O₂.

Résultats

Figure 1 : Taille et orientation optimales de la cavité amniotique pour des injections réussies.) Corne utérine avec plusieurs déciduas E7.5, en forme de chaîne de sphères (en bas) par rapport au gros intestin (en ha...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 mL Seringue	BD Bioscience	309628
27 G Aiguille	BD Bioscience	300635
3,5 pouces capillaires	Drummond Scientific	3000203G/X	Ont été utilisés pour tirer dans les aiguilles de la maison
Sonde 70 MHz MS Series	Visual Sonics	MS700
Aquasonic gel à ultrasons transparent	Parker Laboratories	Mar-50
Applicateur Autoclip 9 mm	Angthos	12020-09
CD1 souris	Charles River, Allemagne	Crl :CD1(ICR)	Femelles : à partir de l’âge de 8 semainesMâles : à partir de l’âge de 12 semaines
Coton-tige	OneMed Sverige AB	120788
DPBS	Gibco	14190094
Pince à pansement délicate droite 13 cm	Agnthos	08-032-130
EZ clips 9 mm	Angthos	59027	Clips
Ciseaux Iris, Super Cut, droit, 9 cm	Agnthos	307-336-090
Isofluorane	Baxter Medical AB	EAN : 50085412586613	Acheté à la pharmacie suédoise
Kimwipes	Kimberly Clarke	7557
Membrane Tape	Visual Sonics	SA-11053
Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Modeling Clay	Sense AB	10209
Table de manipulation de souris	Visual Sonics	50249
Nanoject II Auto Injector Kit	Drummond	3-000-205A
Parafilm	Bemis	HS234526C
Boîte de Pétri avec ouverture centrale (paroi basse)	Visual Sonics	SA-11620
Boîte de Pétri, (ØxH) : 92 x 16 mm	Sarstedt	82.1472.001
Rely+On Virkon	DuPont		130000132037 désinfectant
Membrane silicone	Visual Sonics	SA-11054
Steri 250, stérilisateur à billes chaudes	Angthos	31100
Ruban chirurgical (1,25 cm x 9,14 m)	Medicarrier	67034
Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Système d’anesthésie	Visual Sonics	VS-12055
Vevo Station d’imagerie 2	Visual Sonics	VS-11983
Vevo2100	Visual Sonics	VS-20047
Vicryl 6-0 ; Aiguille C-3, 45 cm filament violet	Agnthos	J384H